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线粒体、溶酶体、内质网等多种细胞器组成的结构相对独立、功能紧密联系的细胞内膜系统，高效支撑了机体正常生理活动功能。细胞内膜系统失调导致细胞代谢稳态失衡，胞内信号网络调节异常，造成不可控的细胞恶性调控，促使肿瘤等恶性疾病发生。

不同细胞器具有各自独特的核酸、蛋白、代谢物质组成，促进了各类生化反应的高效运转，支持其各自独特能量代谢等功能。对细胞器蛋白组学、代谢组学等分析有效揭示了各细胞器在能量代谢平衡等重要细胞活动规律中的独特功能和动态关联。相对的，作为细胞三类主要生物分子组分之一的核酸，其作为细胞器组分的分布规律及其参与细胞代谢功能的研究尚少。因此，对细胞器独特核酸组分及其相关作用蛋白、代谢物质的精细研究将是细胞器调控能量代谢动态行为解析的重要突破口。

长链非编码RNA (LncRNA)作为一类长度大于200 nt的非编码RNA，在细胞代谢、肿瘤发生发展进程中发挥重要调控功能。浙江大学林爱福等课题组在内的一系列前期研究，发现细胞膜脂结合LINK-A促进了细胞质膜PIP3-AKT信号转导【1】，细胞质CamK-A介导了Ca2+信号与NF-κB信号交互【2】，细胞核BCAR4介导了Hedgehoge-Hippo信号转录协同【3】，展现了lncRNA生物学功能与其亚细胞定位的紧密联系。因此，探明LncRNAs细胞空间层级分布及其如何在生理病理条件下动态调控细胞代谢进程及肿瘤病变发生具有重要意义。

2021年01月04日，浙江大学生命科学学院林爱福课题组在Nature Metabolism杂志在线发表题为Mitochondrial Long Non-coding RNA GAS5 Tunes TCA Metabolism in Response to Nutrient Stress的研究论文。该研究通过建立细胞器免疫亲和纯化体系，绘制了细胞器lncRNA图谱，并从中揭示了线粒体lncRNA GAS5在帮助细胞应对能源匮乏条件，介导TCA循环代谢区室解离中的重要调控作用，为研究lncRNA亚细胞空间动态调控与人类疾病发生的联系提供了崭新的视角。

为了精确解析细胞器RNA组分分布，研究者们经过探索优化建立了一套细胞器免疫亲和纯化体系。传统的细胞器纯化方法主要依赖于蔗糖、percoll等介质的密度梯度离心法，根据不同细胞器的不同沉降系数将其分离，但是由于一些细胞器间的沉降系数范围重叠（如线粒体、溶酶体）难以达到精确的RNA检测分辨率。此外，近来揭示的大量颗粒状无膜亚细胞结构，尤其是能抵抗RNase消化的RNA granule类颗粒，往往因其更加离散的沉降系数而导致在各细胞器组分中的污染。因此，作者开发了基于免疫亲和纯化的细胞器纯化方案，使用简化的细胞匀浆-离心法获得轻线粒体组分悬液（LMF），再通过线粒体表面标志蛋白Tom20或溶酶体表面标志蛋白Lamp1的抗体分别捕获LMF悬液中线粒体及溶酶体组分，最后通过Protein A/G磁珠富集并磁性分离得到免疫亲和纯化的完整细胞器。该细胞器免疫亲和纯化体系获得的细胞器可以极大避免细胞器间交叉污染及无膜亚细胞结构的串扰，且因无需提前外源转染或化学处理细胞，可以更好保留细胞器生化表征完整性，适用于不同应激条件处理下的各细胞器组分的动态分析及组织中细胞器的提取分析。

借助上述细胞器免疫亲和纯化体系联合RNA-seq高通量测序分析，作者建立了细胞器lncRNA图谱。该图谱显示免疫亲和纯化法相比传统离心方法具有更好的RNA富集效率及分辨效果，揭示了细胞器lncRNA约占总lncRNA的5.2%。作者进一步通过生信分析、qPCR验证、siRNA筛选，揭示了细胞器lncRNA潜在参与了所在细胞器相关功能的调控。

图1 细胞器免疫亲和纯化体系流程示意图及细胞器lncRNA候选分子的选择

在所建立的细胞器lncRNA图谱中，作者通过细胞器提取-qPCR筛选了高丰度的细胞器lncRNA，再通过线粒体/溶酶体定位的葡萄糖敏感性及线粒体ATP产能/溶酶体表面AMPK激活作为指标，筛选了具有潜在细胞器相关代谢调控功能的细胞器lncRNA，包括线粒体能量代谢功能紧密相关的lncRNA GAS5（Growth-Arrest-Specific 5）。研究者进一步通过FISH、线粒体分离-qPCR、ATP检测、NADH/NAD+检测等实验证实了GAS5的糖敏感性线粒体定位及其对线粒体ATP、NADH产生的影响。GAS5已知报道通过竞争抑制GR（glucocorticoid receptor）转录活性【4】，microRNA缓冲海绵等途径抑制细胞生长增殖【5】，是广泛的抑癌分子【6】。但是这些研究都无法完全解释GAS5的糖敏感性亚细胞空间动态行为及其对线粒体代谢的调控功能。作者通过生物素标记的RNA-pulldown联合蛋白质谱分析，鉴定了GAS5直接靶向作用的线粒体蛋白MDH2（Malate dehydrogenase, mitochondrial）。MDH2是线粒体TCA循环中维持能量代谢稳态循环的节点分子，研究者进一步发现MDH2与其上下游FH、CS可以偶联形成代谢区室，通过反应底物串联帮助MDH2在细胞内完成逆标准吉布斯自由能（ΔG⁰’）反应。敲低GAS5会增强MDH2代谢区室稳定，并削弱该代谢区室对糖的敏感性；而过表达GAS5则可以模拟糖匮乏信号，抑制FH-MDH2-CS代谢区室的形成，并造成柠檬酸、苹果酸水平异常，线粒体能量代谢失调，进而抑制细胞生长增殖。线粒体内往往具有很高的乙酰辅酶A浓度，诸多线粒体代谢相关蛋白受乙酰化修饰调控【7】。通过对MDH2-K185/301/307/314四个乙酰化位点的4KR突变，作者发现MDH2乙酰化修饰对FH-MDH2-CS代谢区室稳定具有中枢作用。GAS5通过动态线粒体转位，可以响应并传递葡萄糖匮乏信号，促进MDH2募集SIRT3并下调MDH2乙酰化修饰，抑制MDH2与FH/CS互作形成区室，从而下调TCA循环代谢流，抑制线粒体代谢。

代谢重排是肿瘤进展重要驱动因子，线粒体代谢提供了大量生物合成的物质原料，对肿瘤发生发展至关重要。研究者发现GAS5在乳腺癌中低表达且与肿瘤良好预后正相关，而MDH2、CS、FH在肿瘤中高表达，与肿瘤不良预后相关。过表达GAS5显著抑制肿瘤中FH-MDH2-CS代谢区室形成，TCA循环及肿瘤增殖，从而证实了线粒体TCA循环对肿瘤发生发展的重要支持作用，而肿瘤低表达GAS5帮助肿瘤细胞规避了能源物质缺乏条件下的线粒体代谢抑制效应，促进了肿瘤进展。

在所建立的细胞器lncRNA图谱中，作者通过细胞器提取-qPCR筛选了高丰度的细胞器lncRNA，再通过线粒体/溶酶体定位的葡萄糖敏感性及线粒体ATP产能/溶酶体表面AMPK激活作为指标，筛选了具有潜在细胞器相关代谢调控功能的细胞器lncRNA，包括线粒体能量代谢功能紧密相关的lncRNA GAS5（Growth-Arrest-Specific 5）。研究者进一步通过FISH、线粒体分离-qPCR、ATP检测、NADH/NAD+检测等实验证实了GAS5的糖敏感性线粒体定位及其对线粒体ATP、NADH产生的影响。GAS5已知报道通过竞争抑制GR（glucocorticoid receptor）转录活性【4】，microRNA缓冲海绵等途径抑制细胞生长增殖【5】，是广泛的抑癌分子【6】。但是这些研究都无法完全解释GAS5的糖敏感性亚细胞空间动态行为及其对线粒体代谢的调控功能。作者通过生物素标记的RNA-pulldown联合蛋白质谱分析，鉴定了GAS5直接靶向作用的线粒体蛋白MDH2（Malate dehydrogenase, mitochondrial）。MDH2是线粒体TCA循环中维持能量代谢稳态循环的节点分子，研究者进一步发现MDH2与其上下游FH、CS可以偶联形成代谢区室，通过反应底物串联帮助MDH2在细胞内完成逆标准吉布斯自由能（ΔG⁰’）反应。敲低GAS5会增强MDH2代谢区室稳定，并削弱该代谢区室对糖的敏感性；而过表达GAS5则可以模拟糖匮乏信号，抑制FH-MDH2-CS代谢区室的形成，并造成柠檬酸、苹果酸水平异常，线粒体能量代谢失调，进而抑制细胞生长增殖。线粒体内往往具有很高的乙酰辅酶A浓度，诸多线粒体代谢相关蛋白受乙酰化修饰调控【7】。通过对MDH2-K185/301/307/314四个乙酰化位点的4KR突变，作者发现MDH2乙酰化修饰对FH-MDH2-CS代谢区室稳定具有中枢作用。GAS5通过动态线粒体转位，可以响应并传递葡萄糖匮乏信号，促进MDH2募集SIRT3并下调MDH2乙酰化修饰，抑制MDH2与FH/CS互作形成区室，从而下调TCA循环代谢流，抑制线粒体代谢。

代谢重排是肿瘤进展重要驱动因子，线粒体代谢提供了大量生物合成的物质原料，对肿瘤发生发展至关重要。研究者发现GAS5在乳腺癌中低表达且与肿瘤良好预后正相关，而MDH2、CS、FH在肿瘤中高表达，与肿瘤不良预后相关。过表达GAS5显著抑制肿瘤中FH-MDH2-CS代谢区室形成，TCA循环及肿瘤增殖，从而证实了线粒体TCA循环对肿瘤发生发展的重要支持作用，而肿瘤低表达GAS5帮助肿瘤细胞规避了能源物质缺乏条件下的线粒体代谢抑制效应，促进了肿瘤进展。

图 2 LncRNA亚细胞分布及线粒体GAS5的机制示意图

总的来说，本研究通过建立细胞器免疫亲和纯化体系，绘制了细胞器lncRNA图谱，并从中揭示了线粒体lncRNA GAS5对TCA循环MDH2代谢区室的重要调节功能，为线粒体代谢支持肿瘤发生发展提供了新的证据，为肿瘤临床诊断提供了新的潜在分子靶标GAS5。

据悉，浙江大学生命科学学/癌症研究院林爱福研究员为该论文的通讯作者。浙江大学生命科学学博士研究生桑凌杰、杨作臻及中山大学肿瘤防治中心鞠怀强副研究员为该论文的共同第一作者。值得一提的是，浙江大学15级本科生龚杭荻同学与16级本科生杨洛嘉同学在该研究探索阶段做出了积极贡献。

刘伟（浙江大学特聘教授、细胞器及自噬领域研究专家）

伴随细胞器形成导致的亚细胞区室化是真核细胞的重要特征之一。细胞内各细胞器通过其不同的生物分子组分行使独特的生物学功能。解析亚细胞核酸、蛋白及代谢物组分及其动态变化规律是揭示细胞器功能及调控机制的有效手段。近年研究显示，RNA在信号转导、代谢调控等生理过程中扮演重要角色，精确检测及解析非编码RNA组分在亚细胞水平的分布和活动，对深入理解细胞器功能调控及细胞器互作网络具有重要意义。

浙江大学林爱福团队的该项研究，通过建立细胞器免疫亲和纯化体系，绘制了细胞器非编码RNA图谱，发现了一类定位不同细胞器并在物质能量传递和细胞器稳态调控中发挥重要功能的非编码RNA家族分子。通过鉴定与线粒体代谢相关的RNA群，揭示了定位线粒体的长链非编码RNA在细胞应激条件下，对线粒体三羧酸循环及能量代谢的重要调控作用。该工作的一个亮点是提供了细胞器RNA系统鉴定的新技术，有效规避了细胞器间交叉污染及无膜亚细胞结构的串扰，充分保留了细胞器内部及表面的原生状态。此外，该研究还揭示了细胞器非编码RNA发挥分子调控机制和生物学效应的动态性和精确性。细胞器RNA图谱的描绘为研究细胞器结构和功能的调控机理，互作方式和互作网络的形成，以及细胞器新的功能的发现，提供了新方法、新视角和新思路，对深入研究细胞器及细胞器互作的生理和病理功能有重要价值。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s42255-020-00325-z

点评 | 刘伟（浙江大学）

责编 | 兮

文章来源：BioArt公众号